测定酶活性为什么要严格控制时间

A. 酶活力测定中为什么各样品与底物测定的时间要严格一致

酶活力测定中为什么各样品与底物测定的时间要严格一致？

答：本实验中用磷酸苯二钠为底物。磷酸苯二钠经过酸性磷酸酯酶作用，水解以后即生成酚和 无机磷，其反应式如下： O || C6H6-O-P-ONa + H2O ≈ C6H6-OH + Na2HPO4 | ONa 由上式可见，当有足够量的底物磷酸苯二钠存在时，酸性磷酸酯酶的活力越高，所生成的产物酚和无机磷也越多。反应速率只在反应的最初一段时间范围内保持恒定。随着时间的延长，底物浓度的降低和产物浓度的升高，使逆反应加强。

B. 化学 酶反应时间为什么要严格控制酶反应温度为什么要严格控制为60℃

生物中酶有两种，一种为蛋白质酶，一种为RNA酶

而化学中的酶主要为蛋白质，或可见化学书中已默认为蛋白质，（这个不用纠结，学什么用什么）
且蛋白质在高温，过酸过碱的情况下都会破坏其结构，使其变性失活，（低温只会抑制其活性，不会改变其化学结构，要注意），所以使用时务必注意。
当然，酶有一个最适温度，在该温度左右，酶的催化功能最强，该温度你自己看着办。

C. 在测定酶活力时,为什么对试剂配置、实际用量、血清用量、温度、PH、作用时间均需严格控制

谷物种子萌发时淀粉酶活力的测定

几乎所有植物中都存在淀粉酶，尤其是萌发的禾谷类种子，淀粉酶活性最强。主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。种子萌发时，淀粉酶活性随萌发时间迅速增加，将淀粉分解成小分子糖类，供幼苗生长。α-淀粉酶随机水解淀粉的α-1，4-糖苷键，作为淀粉分解的起始酶而起主要作用；其水解产物为麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原性糖；β-淀粉酶水解非还原端的第二个α-1，4-糖苷键，水解产物为麦芽糖，并能使一部分糊精糖化。本实验以萌发种子为材料，测定其中α-淀粉酶和β-淀粉酶活性的差异。

【原理】

两种淀粉酶具有不同理化特性，α-淀粉酶不耐酸，在PH3�6以下迅速钝化；β-淀粉酶不耐热，在70℃下15Min则被钝化。据此，在测定时钝化其中之一，就可以测定出另一种酶的活力，本实验采用加热钝化β-淀粉酶测出α-淀粉酶活力，再与非钝化条件下测得的总淀粉酶活力比较，求出β-淀粉酶活力。淀粉的水解产物麦芽糖及其他还原性糖能与3，5-二硝基水杨酸试剂反应，使其还原生成红色3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，其颜色深浅与淀粉酶水解产物的浓度成正比，可用麦芽糖(或葡萄糖)浓度表示，用比色法测定淀粉生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。

【仪器与用具】

分光光度计；离心机；恒温水浴器；研钵；具塞刻度试管25Ml 13支，刻度吸管1ml、2ml、5Ml各1支；容量瓶50Ml 2支。

【试剂】

麦芽糖标准液(1Mg／Ml)：称取100Mg麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至100Ml。

DNS试剂(3，5-二硝基水杨酸)：精确称取3，5-二硝基水杨酸1g，溶于20Ml 12Mol／L NAOH溶液中，加入50Ml蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100Ml。盖紧瓶塞，勿使CO2进入。若溶液混浊，可过滤后使用。

0�1Mol／L PH5�6的柠檬酸缓冲液：A液(0�1Mol／L柠檬酸)：称取分析纯柠檬酸21�01g，用蒸馏水溶解并定容至1L；B液（0�1Mol／L柠檬酸钠）：称取柠檬酸钠29�41g用蒸馏水溶解并定容至1L；取A液55Ml与B液145Ml混匀，即为0�1Mol／L PH5�6的柠檬酸缓冲液。

1％淀粉溶液：称取1g淀粉溶于100Ml 0�1Mol／L PH5�6的柠檬酸缓冲液中。

【方法】

1.酶液提取称取25℃下萌发3～4天的小麦种子1�0g(芽长1�0～1�5CM)，置研钵中，加少量石英砂和2Ml蒸馏水，研磨成匀浆后转入离心管中，用7Ml蒸馏水分次将残渣洗入离心管，提取液在室温下放置提取15～20Min，每隔数分钟搅动1次，使其充分提取。然后在3000r／Min转速下离心10Min，将上清液倒入50Ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液。吸取上述淀粉酶原液5Ml，放入50Ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度摇匀，即为淀粉酶稀释液。

2�麦芽糖标准曲线制作取7支干净的具塞刻度试管，编号，按表18-1加入试剂：

表18-1制作麦芽糖标准曲线配方表

试剂管号1234567麦芽糖标准液（ml)00.20.40.81.21.62.0蒸馏水（ml)2.01.81.61.20.80.40麦芽糖含量（mg)00.20.40.81.21.62.03,5-二硝基水杨酸（ml)2222222摇匀，置沸水浴中煮沸5Min。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20Ml。以1号管作为空白调零点，在540nM波长下比色测定。以麦芽糖含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

3�酶活力的测定取6支干净的具塞刻度试管，编号，按表18-2进行操作。

表18-2酶活力的测定配方表

操作项目管号Ⅰ-1Ⅰ-2Ⅰ-3Ⅱ-1Ⅱ-2Ⅱ-3淀粉酶原液（ml)1.01.01.0000钝化β-淀粉酶置70℃水浴中15Min,取出后在流水中冷却淀粉酶稀释液（ml)000111DNS试剂（ml)2.0002.000预保温40℃恒温水浴中保温10Min1%淀粉溶液（ml)(40℃)1.01.01.01.01.01.0保温40℃恒温水浴中准确保温5MinDNS试剂（ml)02.02.002.02.0摇匀，置沸水浴中5Min，取出后冷却，加蒸馏水至20Ml，摇匀，在540nM波长下比色，记录测定结果。

4�结果计算 用Ⅰ-2、Ⅰ-3吸光度平均值与Ⅰ-1吸光度值之差，在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量(Mg)，再按下式计算α-淀粉酶的活力(Aα)，淀粉酶活性以每克鲜重所含麦芽糖毫克数(Mg／g·Min)表示：

Aα＝CαVTFW×t×V1（18-1）

Ⅱ-2、Ⅱ-3吸光度平均值与Ⅱ-1吸光度值之差，在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量(Mg)，按式18-1计算(α＋β)-淀粉酶的活性AT�

AT＝CT×VTFW×t×V1

式中A:淀粉酶活性，Aα为α-淀粉酶的活性，AT为淀粉酶总活性，主要是α、β-淀粉酶的活性；

Cα:α-淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖量(查标准曲线求值，以下同)；

CT:(α＋β)淀粉酶共同水解淀粉生成的麦芽糖量；

V1:显色所用酶液体积(Ml)；

T:酶作用时间(Min)；

VT:样品稀释液总体积(α-淀粉酶为50Ml，α＋β淀粉酶为500Ml)；

FW:样品鲜重(g)。

【思考题】

1.萌发种子和干种子α-淀粉酶和β-淀粉酶活力有何差异�这种变化有何生物学意义�

2�实验中设置对照的意义何在�

3�α-淀粉酶和β-淀粉酶性质有何不同�作用特点有何不同

D. 淀粉酶活力测定实验中，为什么总是要强调准确反映一定时间

酶活力是反应速率，如果时间不准的话，速率当然不准了，如果因为计算时实验不准而得到低速率，产品方生产时如果参考你的文献时就不会使用这种产品了。它的前途也会受到影响，如果被证实你的数据有问题的话，甚至有可能说你的论文是虚造的......问题很严重

加入缓冲液是因为在水解后溶液体积会变化，而缓冲液的pH相对于单一物质来说更稳定些，酶活变化不大，可以忽略。

E. 测定酶活力要注意控制哪些条件

（1）酶促反应过程中，要用初速度表示酶促反应速度。

（2）要规定时间、温度、pH等反应条件，并在酶测定过程中保持这些反应条件的恒定。

（3）配制的底物浓度应准确且足够大，底物液中应加入不抑制该酶活力的防腐剂并保存于冰箱中，以防止底物被分解。

（4）标本要新鲜，应保存于冰箱中。用血浆时，应考虑到抗凝剂对酶反应的影响。在采血、分离血清时，应注意防止溶血和白细胞的破裂。

（5）在测定过程中，所用仪器应绝对清洁，不应含有酶的抑制物，如酸、碱及蛋白沉淀剂等。

测定酶活力方法介绍：

终点法：该方式是在特定条件下，将样品中要检知的酶作用一定量的底物，然后根据反应进行到某一程度(即达到某一指标)所需要的时间长短来估计酶的活力。

其一个发展是采用检测器对反应进行连续跟踪，并在反应达到某一程度时，精确地自动记录所需要的时间，这就是酶分析自动化中的固定浓度法；另一个发展是作成简便的酶检测纸片。

动力学法：该方式测定原理是在一定条件下，酶促反应速度和酶浓度成正比，因此测得反应速度就需要求得酶浓度。待测的酶浓度是影响反应速度的唯一因素，其他因素都应处于最适于酶发挥催化作用的水平，为此应选择适宜的底物浓度、缓冲体系、温度，并向反应系统中添加必要的辅助因子。

F. 淀粉酶活力测定实验中，为什么要强调时间的一致性

因为其在水中水浴的时候才真正的开始了，酶反应，控制时间主要是为了确保每个试管的反应进度是一样的。这样在同一个基准下，才可以进行研究。

G. 生化试验 测定酶活力时需要对试剂、作用时间等严格控制

淀粉酶活力的测定
一、目的

学习和掌握测定淀粉酶（包括α-淀粉酶和β-淀粉酶）活力的原理和方法。

二、原理

淀粉是植物最主要的贮藏多糖，也是人和动物的重要食物和发酵工业的基本原料。淀粉经淀粉酶作用后生成葡萄糖、麦芽糖等小分子物质而被机体利用。淀粉酶主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶两种。α-淀粉酶可随机地作用于淀粉中的α-1,4-糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此又称为液化酶。β-淀粉酶可从淀粉的非还原性末端进行水解，每次水解下一分子麦芽糖，又被称为糖化酶。淀粉酶催化产生的这些还原糖能使3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，其反应如下：

淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。

淀粉酶存在于几乎所有植物中，特别是萌发后的禾谷类种子，淀粉酶活力最强，其中主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。两种淀粉酶特性不同，α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化。β-淀粉酶不耐热，在70℃15min钝化。根据它们的这种特性，在测定活力时钝化其中之一，就可测出另一种淀粉酶的活力。本实验采用加热的方法钝化β-淀粉酶，测出α-淀粉酶的活力。在非钝化条件下测定淀粉酶总活力（α-淀粉酶活力+β-淀粉酶活力），再减去α-淀粉酶的活力，就可求出β-淀粉酶的活力。

三、实验材料、主要仪器和试剂

1．实验材料

萌发的小麦种子（芽长约1cm）

2．仪器

（1）离心机

（2）离心管

（3）研钵

（4）电炉

（5）容量瓶：50mL×1, 100mL×1

（6）恒温水浴

（7）20mL具塞刻度试管×13

（8）试管架

（9）刻度吸管：2mL×3, 1mL×2, 10mL×1

（10）分光光度计

3．试剂（均为分析纯）

（1）标准麦芽糖溶液（1mg/mL）：精确称取100mg麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至100mL。

（2）3,5-二硝基水杨酸试剂：精确称取3,5-二硝基水杨酸1g，溶于20mL 2mol/L NaOH溶液中，加入50mL蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100mL。盖紧瓶塞，勿使CO2进入。若溶液混浊可过滤后使用。

（3）0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液

A液：（0.1mol/L 柠檬酸）：称取C6H8O7·H2O 21.01g，用蒸馏水溶解并定容至1L。

B液：（0.1mol/L柠檬酸钠）：称取Na3C6H5O7·2H2O 29.41g，用蒸馏水溶解并定容至1L。

取A液55mL与B液145mL混匀，既为0.1mol/LpH5.6的柠檬酸缓冲液。

（4）1%淀粉溶液：称取1g淀粉溶于100mL 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中。

四、操作步骤

1．麦芽糖标准曲线的制作

取7支干净的具塞刻度试管，编号，按表1加入试剂：

表1 麦芽糖标准曲线制作

试 剂
管 号

1
2
3
4
5
6
7

麦芽糖标准液（mL）
0
0.2
0.6
1.0
1.4
1.8
2.0

蒸馏水（mL）
2.0
1.8
1.4
1.0
0.6
0.2
0

麦芽糖含量（mg）
0
0.2
0.6
1.0
1.4
1.8
2.0

3,5-二硝基水杨酸（mL）
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0

摇匀，置沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20mL。以1号管作为空白调零点，在540nm波长下比色测定光密度。以麦芽糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。

2．淀粉酶液的制备

称取1g萌发3天的小麦种子（芽长约1cm），置于研钵中，加入少量石英砂和2mL蒸馏水，研磨匀浆。将匀浆倒入离心管中，用6mL蒸馏水分次将残渣洗入离心管。提取液在室温下放置提取15～20min，每隔数分钟搅动1次，使其充分提取。然后在3 000r/min转速下离心10min，将上清液倒入100mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液，用于α-淀粉酶活力测定。

吸取上述淀粉酶原液10mL，放入50mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶稀释液，用于淀粉酶总活力的测定。

2． 酶活力的测定：取6支干净的试管，编号，按表2进行操作。

表2 酶活力测定取样表

操 作 项 目 α‑淀粉酶活力测定 β-淀粉酶活力测定

Ⅰ- 1 Ⅰ- 2 Ⅰ- 3 Ⅱ- 4 Ⅱ- 5 Ⅱ- 6

淀粉酶原液（mL） 1.0 1.0 1.0 0 0 0

钝化β-淀粉酶 置70℃水浴15min，冷却

淀粉酶稀释液（mL） 0 0 0 1.0 1.0 1.0

3,5-二硝基水杨酸（mL） 2.0 0 0 2.0 0. 0

预保温 将各试管和淀粉溶液置于40℃恒温水浴中保温10min

1%淀粉溶液（mL） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

保温 在40℃恒温水浴中准确保温5min

3,5-二硝基水杨酸（mL） 0 2.0 2.0 0 2.0 2.0

将各试管摇匀，显色后进行比色测定光密度，记录测定结果，操作同标准曲线。

五、结果计算

计算Ⅰ- 2、Ⅰ- 3光密度平均值与Ⅰ- 1光密度之差，在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量（mg），按下列公式计算α- 淀粉酶的活力。

计算Ⅱ- 2、Ⅱ- 3光密度平均值与Ⅱ- 1光密度之差，在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量（mg），按下式计算（α＋β）淀粉酶总活力。

β-淀粉酶活力＝（α＋β）淀粉酶总活力－α-淀粉酶活力

六、附 注

（1）样品提取液的定容体积和酶液稀释倍数可根据不同材料酶活性的大小而定。

（2）为了确保酶促反应时间的准确性，在进行保温这一步骤时，可以将各试管每隔一定时间依次放入恒温水浴，准确记录时间，到达5min时取出试管，立即加入3,5-二硝基水杨酸以终止酶反应，以便尽量减小因各试管保温时间不同而引起的误差。同时恒温水浴温度变化应不超过±0.5℃。

（3）如果条件允许，各实验小组可采用不同材料，例如萌发1d、2d、3d、4d的小麦种子，比较测定结果，以了解萌发过程中这两种淀粉酶活性的变化。

推荐网址：
http://www.estarch.com/news/26/news_6498.html
http://www.bbioo.com/bio101/2006/7201.htm
http://www.scuta.e.cn/yuanxi/bylw/syzd/srdsyzdsy18.htm

H. 酶活力测定的注意事项有哪些

测定酶活力时，必须注意以下几点：

1、酶促反应过程中，只有最初一段时间内反应速度与酶浓度成正比，随着反应时间的延长，反应速度即逐渐降低。

2、要规定一定的反应条件，如时间、温度、pH等，并在酶测定过程中保持这些反应条件的恒定，如温度不得超过规定温度的士1℃，pH应恒定。

3、配制的底物浓度应准确且足够大，底物液中应加入不抑制该酶活力的防腐剂并保存于冰箱中，以防止底物被分解。

4、标本要新鲜，由于绝大多数酶可因久置而活力降低，标本如无法及时测定，应保存于冰箱中。用血浆时，应考虑到抗凝剂对酶反应的影响。有些酶在血细胞、血小板中的浓度比血清高，为此在采血、分离血清时，应注意防止溶血和白细胞的破裂。

5、在测定过程中，所用仪器应绝对清洁，不应含有酶的抑制物，如酸、碱、蛋白沉淀剂等。

(8)测定酶活性为什么要严格控制时间扩展阅读：

酶活力

1、单位：在特定条件下，1分钟内转化1微摩尔底物所需的酶量为一个活力单位(U)。温度规定为25度，其他条件取反应的最适条件。

2、比活力：每毫克酶蛋白所具有的酶活力。单位是u/mg。比活力越高则酶越纯。

3、转化数：每分子酶或每个酶活性中心在单位时间内能催化的底物分子数(TN)。相当于酶反应的速度常数kp。也称为催化常数（Kcat）。1/kp称为催化周期。碳酸酐酶是已知转换数最高的酶之一，高达36×106每分，催化周期为1.7微秒。

I. 测定蛋白酶活力时为什么要严格控制反应时间

因为酶活力单位的规定就是，根据酶在最适条件下，单位时间内作用的底物减少量或产物的生成量来规定的。

J. 为什么在测酶活时,酪蛋白和酶的反应时间必须精确

保证在酶的稳定反应状况之下获取可比数据。
测酶活力常用其催化某一化学反应的能力来表示。在酶活力测定中酪蛋白和酶的反应时间要控制严格一致，使之均处于线性范围和稳定的初速度之中，以保持两组数据之间稳定的相关性和可比性。
酶活力也称为酶活性，测量酶活力的原因是测定酶催化一定化学反应的能力。酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。