測定酶活性為什麼要嚴格控制時間

A. 酶活力測定中為什麼各樣品與底物測定的時間要嚴格一致

酶活力測定中為什麼各樣品與底物測定的時間要嚴格一致？

答：本實驗中用磷酸苯二鈉為底物。磷酸苯二鈉經過酸性磷酸酯酶作用，水解以後即生成酚和 無機磷，其反應式如下： O || C6H6-O-P-ONa + H2O ≈ C6H6-OH + Na2HPO4 | ONa 由上式可見，當有足夠量的底物磷酸苯二鈉存在時，酸性磷酸酯酶的活力越高，所生成的產物酚和無機磷也越多。反應速率只在反應的最初一段時間范圍內保持恆定。隨著時間的延長，底物濃度的降低和產物濃度的升高，使逆反應加強。

B. 化學 酶反應時間為什麼要嚴格控制酶反應溫度為什麼要嚴格控制為60℃

生物中酶有兩種，一種為蛋白質酶，一種為RNA酶

而化學中的酶主要為蛋白質，或可見化學書中已默認為蛋白質，（這個不用糾結，學什麼用什麼）
且蛋白質在高溫，過酸過鹼的情況下都會破壞其結構，使其變性失活，（低溫只會抑制其活性，不會改變其化學結構，要注意），所以使用時務必注意。
當然，酶有一個最適溫度，在該溫度左右，酶的催化功能最強，該溫度你自己看著辦。

C. 在測定酶活力時,為什麼對試劑配置、實際用量、血清用量、溫度、PH、作用時間均需嚴格控制

穀物種子萌發時澱粉酶活力的測定

幾乎所有植物中都存在澱粉酶，尤其是萌發的禾穀類種子，澱粉酶活性最強。主要是α-澱粉酶和β-澱粉酶。種子萌發時，澱粉酶活性隨萌發時間迅速增加，將澱粉分解成小分子糖類，供幼苗生長。α-澱粉酶隨機水解澱粉的α-1，4-糖苷鍵，作為澱粉分解的起始酶而起主要作用；其水解產物為麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原性糖；β-澱粉酶水解非還原端的第二個α-1，4-糖苷鍵，水解產物為麥芽糖，並能使一部分糊精糖化。本實驗以萌發種子為材料，測定其中α-澱粉酶和β-澱粉酶活性的差異。

【原理】

兩種澱粉酶具有不同理化特性，α-澱粉酶不耐酸，在PH3�6以下迅速鈍化；β-澱粉酶不耐熱，在70℃下15Min則被鈍化。據此，在測定時鈍化其中之一，就可以測定出另一種酶的活力，本實驗採用加熱鈍化β-澱粉酶測出α-澱粉酶活力，再與非鈍化條件下測得的總澱粉酶活力比較，求出β-澱粉酶活力。澱粉的水解產物麥芽糖及其他還原性糖能與3，5-二硝基水楊酸試劑反應，使其還原生成紅色3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內，其顏色深淺與澱粉酶水解產物的濃度成正比，可用麥芽糖(或葡萄糖)濃度表示，用比色法測定澱粉生成的還原糖的量，以單位重量樣品在一定時間內生成的麥芽糖的量表示酶活力。

【儀器與用具】

分光光度計；離心機；恆溫水浴器；研缽；具塞刻度試管25Ml 13支，刻度吸管1ml、2ml、5Ml各1支；容量瓶50Ml 2支。

【試劑】

麥芽糖標准液(1Mg／Ml)：稱取100Mg麥芽糖，用蒸餾水溶解並定容至100Ml。

DNS試劑(3，5-二硝基水楊酸)：精確稱取3，5-二硝基水楊酸1g，溶於20Ml 12Mol／L NAOH溶液中，加入50Ml蒸餾水，再加入30g酒石酸鉀鈉，待溶解後用蒸餾水定容至100Ml。蓋緊瓶塞，勿使CO2進入。若溶液混濁，可過濾後使用。

0�1Mol／L PH5�6的檸檬酸緩沖液：A液(0�1Mol／L檸檬酸)：稱取分析純檸檬酸21�01g，用蒸餾水溶解並定容至1L；B液（0�1Mol／L檸檬酸鈉）：稱取檸檬酸鈉29�41g用蒸餾水溶解並定容至1L；取A液55Ml與B液145Ml混勻，即為0�1Mol／L PH5�6的檸檬酸緩沖液。

1％澱粉溶液：稱取1g澱粉溶於100Ml 0�1Mol／L PH5�6的檸檬酸緩沖液中。

【方法】

1.酶液提取稱取25℃下萌發3～4天的小麥種子1�0g(芽長1�0～1�5CM)，置研缽中，加少量石英砂和2Ml蒸餾水，研磨成勻漿後轉入離心管中，用7Ml蒸餾水分次將殘渣洗入離心管，提取液在室溫下放置提取15～20Min，每隔數分鍾攪動1次，使其充分提取。然後在3000r／Min轉速下離心10Min，將上清液倒入50Ml容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，即為澱粉酶原液。吸取上述澱粉酶原液5Ml，放入50Ml容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度搖勻，即為澱粉酶稀釋液。

2�麥芽糖標准曲線製作取7支幹凈的具塞刻度試管，編號，按表18-1加入試劑：

表18-1製作麥芽糖標准曲線配方表

試劑管號1234567麥芽糖標准液（ml)00.20.40.81.21.62.0蒸餾水（ml)2.01.81.61.20.80.40麥芽糖含量（mg)00.20.40.81.21.62.03,5-二硝基水楊酸（ml)2222222搖勻，置沸水浴中煮沸5Min。取出後流水冷卻，加蒸餾水定容至20Ml。以1號管作為空白調零點，在540nM波長下比色測定。以麥芽糖含量為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標准曲線。

3�酶活力的測定取6支幹凈的具塞刻度試管，編號，按表18-2進行操作。

表18-2酶活力的測定配方表

操作項目管號Ⅰ-1Ⅰ-2Ⅰ-3Ⅱ-1Ⅱ-2Ⅱ-3澱粉酶原液（ml)1.01.01.0000鈍化β-澱粉酶置70℃水浴中15Min,取出後在流水中冷卻澱粉酶稀釋液（ml)000111DNS試劑（ml)2.0002.000預保溫40℃恆溫水浴中保溫10Min1%澱粉溶液（ml)(40℃)1.01.01.01.01.01.0保溫40℃恆溫水浴中准確保溫5MinDNS試劑（ml)02.02.002.02.0搖勻，置沸水浴中5Min，取出後冷卻，加蒸餾水至20Ml，搖勻，在540nM波長下比色，記錄測定結果。

4�結果計算 用Ⅰ-2、Ⅰ-3吸光度平均值與Ⅰ-1吸光度值之差，在標准曲線上查出相應的麥芽糖含量(Mg)，再按下式計算α-澱粉酶的活力(Aα)，澱粉酶活性以每克鮮重所含麥芽糖毫克數(Mg／g·Min)表示：

Aα＝CαVTFW×t×V1（18-1）

Ⅱ-2、Ⅱ-3吸光度平均值與Ⅱ-1吸光度值之差，在標准曲線上查出相應的麥芽糖含量(Mg)，按式18-1計算(α＋β)-澱粉酶的活性AT�

AT＝CT×VTFW×t×V1

式中A:澱粉酶活性，Aα為α-澱粉酶的活性，AT為澱粉酶總活性，主要是α、β-澱粉酶的活性；

Cα:α-澱粉酶水解澱粉生成的麥芽糖量(查標准曲線求值，以下同)；

CT:(α＋β)澱粉酶共同水解澱粉生成的麥芽糖量；

V1:顯色所用酶液體積(Ml)；

T:酶作用時間(Min)；

VT:樣品稀釋液總體積(α-澱粉酶為50Ml，α＋β澱粉酶為500Ml)；

FW:樣品鮮重(g)。

【思考題】

1.萌發種子和干種子α-澱粉酶和β-澱粉酶活力有何差異�這種變化有何生物學意義�

2�實驗中設置對照的意義何在�

3�α-澱粉酶和β-澱粉酶性質有何不同�作用特點有何不同

D. 澱粉酶活力測定實驗中，為什麼總是要強調准確反映一定時間

酶活力是反應速率，如果時間不準的話，速率當然不準了，如果因為計算時實驗不準而得到低速率，產品方生產時如果參考你的文獻時就不會使用這種產品了。它的前途也會受到影響，如果被證實你的數據有問題的話，甚至有可能說你的論文是虛造的......問題很嚴重

加入緩沖液是因為在水解後溶液體積會變化，而緩沖液的pH相對於單一物質來說更穩定些，酶活變化不大，可以忽略。

E. 測定酶活力要注意控制哪些條件

（1）酶促反應過程中，要用初速度表示酶促反應速度。

（2）要規定時間、溫度、pH等反應條件，並在酶測定過程中保持這些反應條件的恆定。

（3）配製的底物濃度應准確且足夠大，底物液中應加入不抑制該酶活力的防腐劑並保存於冰箱中，以防止底物被分解。

（4）標本要新鮮，應保存於冰箱中。用血漿時，應考慮到抗凝劑對酶反應的影響。在采血、分離血清時，應注意防止溶血和白細胞的破裂。

（5）在測定過程中，所用儀器應絕對清潔，不應含有酶的抑制物，如酸、鹼及蛋白沉澱劑等。

測定酶活力方法介紹：

終點法：該方式是在特定條件下，將樣品中要檢知的酶作用一定量的底物，然後根據反應進行到某一程度(即達到某一指標)所需要的時間長短來估計酶的活力。

其一個發展是採用檢測器對反應進行連續跟蹤，並在反應達到某一程度時，精確地自動記錄所需要的時間，這就是酶分析自動化中的固定濃度法；另一個發展是作成簡便的酶檢測紙片。

動力學法：該方式測定原理是在一定條件下，酶促反應速度和酶濃度成正比，因此測得反應速度就需要求得酶濃度。待測的酶濃度是影響反應速度的唯一因素，其他因素都應處於最適於酶發揮催化作用的水平，為此應選擇適宜的底物濃度、緩沖體系、溫度，並向反應系統中添加必要的輔助因子。

F. 澱粉酶活力測定實驗中，為什麼要強調時間的一致性

因為其在水中水浴的時候才真正的開始了，酶反應，控制時間主要是為了確保每個試管的反應進度是一樣的。這樣在同一個基準下，才可以進行研究。

G. 生化試驗 測定酶活力時需要對試劑、作用時間等嚴格控制

澱粉酶活力的測定
一、目的

學習和掌握測定澱粉酶（包括α-澱粉酶和β-澱粉酶）活力的原理和方法。

二、原理

澱粉是植物最主要的貯藏多糖，也是人和動物的重要食物和發酵工業的基本原料。澱粉經澱粉酶作用後生成葡萄糖、麥芽糖等小分子物質而被機體利用。澱粉酶主要包括α-澱粉酶和β-澱粉酶兩種。α-澱粉酶可隨機地作用於澱粉中的α-1,4-糖苷鍵，生成葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖，同時使澱粉的粘度降低，因此又稱為液化酶。β-澱粉酶可從澱粉的非還原性末端進行水解，每次水解下一分子麥芽糖，又被稱為糖化酶。澱粉酶催化產生的這些還原糖能使3,5-二硝基水楊酸還原，生成棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸，其反應如下：

澱粉酶活力的大小與產生的還原糖的量成正比。用標准濃度的麥芽糖溶液製作標准曲線，用比色法測定澱粉酶作用於澱粉後生成的還原糖的量，以單位重量樣品在一定時間內生成的麥芽糖的量表示酶活力。

澱粉酶存在於幾乎所有植物中，特別是萌發後的禾穀類種子，澱粉酶活力最強，其中主要是α-澱粉酶和β-澱粉酶。兩種澱粉酶特性不同，α-澱粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速鈍化。β-澱粉酶不耐熱，在70℃15min鈍化。根據它們的這種特性，在測定活力時鈍化其中之一，就可測出另一種澱粉酶的活力。本實驗採用加熱的方法鈍化β-澱粉酶，測出α-澱粉酶的活力。在非鈍化條件下測定澱粉酶總活力（α-澱粉酶活力+β-澱粉酶活力），再減去α-澱粉酶的活力，就可求出β-澱粉酶的活力。

三、實驗材料、主要儀器和試劑

1．實驗材料

萌發的小麥種子（芽長約1cm）

2．儀器

（1）離心機

（2）離心管

（3）研缽

（4）電爐

（5）容量瓶：50mL×1, 100mL×1

（6）恆溫水浴

（7）20mL具塞刻度試管×13

（8）試管架

（9）刻度吸管：2mL×3, 1mL×2, 10mL×1

（10）分光光度計

3．試劑（均為分析純）

（1）標准麥芽糖溶液（1mg/mL）：精確稱取100mg麥芽糖，用蒸餾水溶解並定容至100mL。

（2）3,5-二硝基水楊酸試劑：精確稱取3,5-二硝基水楊酸1g，溶於20mL 2mol/L NaOH溶液中，加入50mL蒸餾水，再加入30g酒石酸鉀鈉，待溶解後用蒸餾水定容至100mL。蓋緊瓶塞，勿使CO2進入。若溶液混濁可過濾後使用。

（3）0.1mol/L pH5.6的檸檬酸緩沖液

A液：（0.1mol/L 檸檬酸）：稱取C6H8O7·H2O 21.01g，用蒸餾水溶解並定容至1L。

B液：（0.1mol/L檸檬酸鈉）：稱取Na3C6H5O7·2H2O 29.41g，用蒸餾水溶解並定容至1L。

取A液55mL與B液145mL混勻，既為0.1mol/LpH5.6的檸檬酸緩沖液。

（4）1%澱粉溶液：稱取1g澱粉溶於100mL 0.1mol/L pH5.6的檸檬酸緩沖液中。

四、操作步驟

1．麥芽糖標准曲線的製作

取7支幹凈的具塞刻度試管，編號，按表1加入試劑：

表1 麥芽糖標准曲線製作

試 劑
管 號

1
2
3
4
5
6
7

麥芽糖標准液（mL）
0
0.2
0.6
1.0
1.4
1.8
2.0

蒸餾水（mL）
2.0
1.8
1.4
1.0
0.6
0.2
0

麥芽糖含量（mg）
0
0.2
0.6
1.0
1.4
1.8
2.0

3,5-二硝基水楊酸（mL）
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0

搖勻，置沸水浴中煮沸5min。取出後流水冷卻，加蒸餾水定容至20mL。以1號管作為空白調零點，在540nm波長下比色測定光密度。以麥芽糖含量為橫坐標，光密度為縱坐標，繪制標准曲線。

2．澱粉酶液的制備

稱取1g萌發3天的小麥種子（芽長約1cm），置於研缽中，加入少量石英砂和2mL蒸餾水，研磨勻漿。將勻漿倒入離心管中，用6mL蒸餾水分次將殘渣洗入離心管。提取液在室溫下放置提取15～20min，每隔數分鍾攪動1次，使其充分提取。然後在3 000r/min轉速下離心10min，將上清液倒入100mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，即為澱粉酶原液，用於α-澱粉酶活力測定。

吸取上述澱粉酶原液10mL，放入50mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，即為澱粉酶稀釋液，用於澱粉酶總活力的測定。

2． 酶活力的測定：取6支幹凈的試管，編號，按表2進行操作。

表2 酶活力測定取樣表

操 作 項 目 α‑澱粉酶活力測定 β-澱粉酶活力測定

Ⅰ- 1 Ⅰ- 2 Ⅰ- 3 Ⅱ- 4 Ⅱ- 5 Ⅱ- 6

澱粉酶原液（mL） 1.0 1.0 1.0 0 0 0

鈍化β-澱粉酶 置70℃水浴15min，冷卻

澱粉酶稀釋液（mL） 0 0 0 1.0 1.0 1.0

3,5-二硝基水楊酸（mL） 2.0 0 0 2.0 0. 0

預保溫 將各試管和澱粉溶液置於40℃恆溫水浴中保溫10min

1%澱粉溶液（mL） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

保溫 在40℃恆溫水浴中准確保溫5min

3,5-二硝基水楊酸（mL） 0 2.0 2.0 0 2.0 2.0

將各試管搖勻，顯色後進行比色測定光密度，記錄測定結果，操作同標准曲線。

五、結果計算

計算Ⅰ- 2、Ⅰ- 3光密度平均值與Ⅰ- 1光密度之差，在標准曲線上查出相應的麥芽糖含量（mg），按下列公式計算α- 澱粉酶的活力。

計算Ⅱ- 2、Ⅱ- 3光密度平均值與Ⅱ- 1光密度之差，在標准曲線上查出相應的麥芽糖含量（mg），按下式計算（α＋β）澱粉酶總活力。

β-澱粉酶活力＝（α＋β）澱粉酶總活力－α-澱粉酶活力

六、附 注

（1）樣品提取液的定容體積和酶液稀釋倍數可根據不同材料酶活性的大小而定。

（2）為了確保酶促反應時間的准確性，在進行保溫這一步驟時，可以將各試管每隔一定時間依次放入恆溫水浴，准確記錄時間，到達5min時取出試管，立即加入3,5-二硝基水楊酸以終止酶反應，以便盡量減小因各試管保溫時間不同而引起的誤差。同時恆溫水浴溫度變化應不超過±0.5℃。

（3）如果條件允許，各實驗小組可採用不同材料，例如萌發1d、2d、3d、4d的小麥種子，比較測定結果，以了解萌發過程中這兩種澱粉酶活性的變化。

推薦網址：
http://www.estarch.com/news/26/news_6498.html
http://www.bbioo.com/bio101/2006/7201.htm
http://www.scuta.e.cn/yuanxi/bylw/syzd/srdsyzdsy18.htm

H. 酶活力測定的注意事項有哪些

測定酶活力時，必須注意以下幾點：

1、酶促反應過程中，只有最初一段時間內反應速度與酶濃度成正比，隨著反應時間的延長，反應速度即逐漸降低。

2、要規定一定的反應條件，如時間、溫度、pH等，並在酶測定過程中保持這些反應條件的恆定，如溫度不得超過規定溫度的士1℃，pH應恆定。

3、配製的底物濃度應准確且足夠大，底物液中應加入不抑制該酶活力的防腐劑並保存於冰箱中，以防止底物被分解。

4、標本要新鮮，由於絕大多數酶可因久置而活力降低，標本如無法及時測定，應保存於冰箱中。用血漿時，應考慮到抗凝劑對酶反應的影響。有些酶在血細胞、血小板中的濃度比血清高，為此在采血、分離血清時，應注意防止溶血和白細胞的破裂。

5、在測定過程中，所用儀器應絕對清潔，不應含有酶的抑制物，如酸、鹼、蛋白沉澱劑等。

(8)測定酶活性為什麼要嚴格控制時間擴展閱讀：

酶活力

1、單位：在特定條件下，1分鍾內轉化1微摩爾底物所需的酶量為一個活力單位(U)。溫度規定為25度，其他條件取反應的最適條件。

2、比活力：每毫克酶蛋白所具有的酶活力。單位是u/mg。比活力越高則酶越純。

3、轉化數：每分子酶或每個酶活性中心在單位時間內能催化的底物分子數(TN)。相當於酶反應的速度常數kp。也稱為催化常數（Kcat）。1/kp稱為催化周期。碳酸酐酶是已知轉換數最高的酶之一，高達36×106每分，催化周期為1.7微秒。

I. 測定蛋白酶活力時為什麼要嚴格控制反應時間

因為酶活力單位的規定就是，根據酶在最適條件下，單位時間內作用的底物減少量或產物的生成量來規定的。

J. 為什麼在測酶活時,酪蛋白和酶的反應時間必須精確

保證在酶的穩定反應狀況之下獲取可比數據。
測酶活力常用其催化某一化學反應的能力來表示。在酶活力測定中酪蛋白和酶的反應時間要控制嚴格一致，使之均處於線性范圍和穩定的初速度之中，以保持兩組數據之間穩定的相關性和可比性。
酶活力也稱為酶活性，測量酶活力的原因是測定酶催化一定化學反應的能力。酶活力的大小可用在一定條件下，酶催化某一化學反應的速度來表示，酶催化反應速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。測定酶活力實際就是測定酶促反應的速度。