質粒小提時間為什麼比大提時間短

A. 什麼是質粒大提 小提

質粒大提是質粒大量提取的簡稱，有些實驗室稱之為大抽。顧名思義就是一次性大量培養細菌，大規模地從細菌中將擴增的質粒提取出來。一般質粒大量制備的用途是用於細胞的轉染，一來是因為可以大量獲得DNA，另外就是因為現在實驗室質粒大提都是使用質粒大提純化柱，如QIAGEN等等。提取出來的質粒純度高，雜質少，無內毒素，是直接轉染級別的。
那麼質粒小提就是小量制備，小量抽提了，提取的方法有鹼裂解法等，也可以用小量質粒提取的純化柱，現在有很多國內的生物公司自己也在生產了，質量還不錯。但提取出來的DNA量比較少，純度達不到細胞轉染級別，只能用於後續的酶切，測序等等工作。
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B. 質粒小量提取跟大量提取有什麼區別

區別：

1、所需菌液不同。大提用於大量菌液的提取，100ml-500ml 均可，而小提用的菌液量很少，一般1.5-5ml。

2、純度不同。一般試劑盒中大提比小提多了溶菌酶、異丙醇（回收沉澱核酸）、含一定量PEG的氯化物（回收質粒DNA）及乙酸銨等，其作用及目的都是有利於細菌的裂解和質粒的純化，所以大提的產物比小提的量多很多，而且純度很高。

3、實驗要求不同。小提一般用於質粒鑒定和對純度要求不是很高的實驗，大提用於質粒的大量提取和轉染等純度要求很高的實驗。

(2)質粒小提時間為什麼比大提時間短擴展閱讀：

大提質粒和小提質粒的基本原理是一樣的，都是通過一定的方法（如加鹼裂解）使在細菌內大量擴增的質粒釋放出來，然後經過去蛋白去RNA等一系列步驟純化DNA，最終將DNA提取出來。

選用質粒（最常用）做載體的4點要求：

1）選分子量小的質粒，即小載體（1－1.5 kb）→不易損壞，在細菌裡面拷貝數也多（也有大載體）；

2）一般使用鬆弛型質粒在細菌里擴增不受約束，一般 10 個以上的拷貝，而嚴謹型質粒 < 10 個。

3）必需具備一個以上的酶切位點，有選擇的餘地；

4）必需有易檢測的標記，多是抗生素的抗性基因，不特指多位 Ampr（試一試）。

無論選用哪種載體，首先都要獲得載體分子，然後採用適當的限制酶將載體 DNA 進行切割，獲得分子，以便於與目的基因片段進行連接。

C. 質粒的小量提取和大量提取的目的有什麼不同謝謝。

這里有兩種情況大提：
1，質粒本身拷貝數低，需要大量提取，才能用以載體構建，比如pBI121
2，已經構建好的質粒載體，需要大量轉化質粒DNA。
一般情況下均為小提，做酶切鑒定或PCR足夠。

D. 5K質粒小量提取可以,大量提取就越來越少

通常是因為在細菌擴增培養過程中混有雜菌，導致含有目的質粒的細菌比例下降。通常挑克隆小規模培養後提質粒通常發現不了，質粒產量也很不錯，但一擴增培養質粒就提不出來了。建議挑取克隆鑒定成功後再用平皿把培養成功的菌液再分離一下，得到比較散在的克隆然後再擴增培養。在大提之前先小提1ml鑒定一下以確認沒有問題。

回復 Tiny_Feng001： 換菌種！我一直用某國產公司的感受態細胞，時間長了有時就提不出質粒來，通常多試幾次才能得到很勉強的結果。怎麼接種、挑克隆也不管用！近來問題越來越嚴重。師弟從Promega定了感受態，用原來小提的質粒一轉，擴增，結果很OK！強烈建議樓主更換感受態。

E. 請教質粒小提

大提質粒和小提質粒的基本原理是一樣的，都是通過一定的方法（如加鹼裂解）使在細菌內大量擴增的質粒釋放出來，然後經過去蛋白去RNA等一系列步驟純化DNA，最終將DNA提取出來。區別：

1. 大提用於大量菌液的提取，100ml-500ml 均可，而小提用的菌液量很少，一般1.5-5ml。

2. 2.一般試劑盒中大提比小提多了溶菌酶、異丙醇（回收沉澱核酸）、含一定量PEG的氯化物（回收質粒DNA）及乙酸銨等，其作用及目的都是有利於細菌的裂解和質粒的純化，所以大提的產物比小提的量多很多，而且純度很高。

3. 3.小提一般用於質粒鑒定和對純度要求不是很高的實驗，大提用於質粒的大量提取和轉染等純度要求很高的實驗。
   

F. 5K質粒小量提取可以,大量提取就越來越少

5K質粒算小的，應該和質粒沒什麼關系，最好再找找大抽的原因。
搖菌對抽質粒非常關鍵，搖少了搖老了都不好，你最好做個時間梯度的實驗看看。
（順便確認下質粒是不是鬆弛型的）

G. 質粒的提取原理

質粒提取是指去除 RNA，將質粒與細菌基因組 DNA分開，去除蛋白質及其它雜質，以得到相對純凈的質粒。

目錄

一、質粒提取原理

質粒是細胞內的一種環狀的小分子DNA，是進行DNA重組的常用載體。作為一個具有自身復制起點的復制單位獨立於細胞的主染色體之外，質粒DNA上攜帶了部分的基因信息，經過基因表達後使其宿主細胞表現相應的性狀。在DNA重組中，質粒或經過改造後的質粒載體可通過連接外源基因構成重組體。

從宿主細胞中提取質粒DNA，是DNA重組技術中最基礎的實驗技能。分離質粒DNA有三個步驟：培養細菌使質粒擴增，收集和裂解細菌，分離和純化質粒DNA。

在質粒提取過程中，由於機械力、酸鹼度、試劑等的原因，可能使質粒DNA鏈發生斷裂。所以，多數質粒粗提取物中含有三種構型的質粒：共價閉合環狀DNA（cccDNA）： 質粒的兩條鏈沒有斷裂；超螺旋開環DNA（ocDNA）： 質粒的一條鏈斷裂；鬆弛的環狀分子線形DNA（lDNA）： 質粒的兩條鏈均斷裂；線性分子質粒DNA的分子構型 。

質粒DNA瓊脂塘凝膠電泳模式圖可分為：鬆弛線性的DNA； 鬆弛開環的OC構型； 超螺旋的SC構型。由於瓊脂糖中加有嵌入型染料溴化乙錠，因此，在紫外線照射下DNA電泳帶成橘黃色。 道中的SC DNA走在最前沿，OC DNA則位於凝膠的最後邊；道中的L DNA 是經核酸內切限制酶切割質粒之後產生的，它在凝膠中的位置介於OC DNA 和 SC DNA 之間。

二、質粒提取方法

質粒DNA的提取方法主要有鹼裂解法、煮沸法、酚氯仿裂解法。跟據不同的實驗目的和儀器設備擇取不同的實驗方案。

(一) 鹼裂解法：

此方法適用於小量質粒DNA的提取，提取的質粒DNA可直接用於酶切、PCR擴增、銀染序列分析。方法如下：

1. 接1%含質粒的大腸桿菌細胞於2ml LB培養基。

2. 37℃振盪培養過夜。

3. 取1.5ml菌體於Ep管，以4000rpm離心3min，棄上清液。

4. 加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。

5. 加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH，1％ SDS)，輕輕翻轉混勻，置於冰浴5 min 。

6. 加入0.15m1預冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，輕輕翻轉混勻，置於冰浴5 min 。

7. 以10，000rpm離心20min，取上清液於另一新Ep管

8. 加入等體積的異戊醇，混勻後於0℃靜置10min。

9. 再以10，000rpm離心20min，棄上清。

10. 用70％乙醇0.5ml洗滌一次，抽干所有液體。

11. 待沉澱乾燥後，溶於0.05mlTE緩沖液中

(二) 煮沸法：

1. 將1.5ml培養液倒入eppendorf管中，4℃下12000g離心30秒。

2. 棄上清，將管倒置於衛生紙上幾分鍾，使液體流盡。

3. 將菌體沉澱懸浮於120ml STET溶液中，渦旋混勻。

4. 加入10ml新配製的溶菌酶溶液(10mg/ml)， 渦旋振盪3秒鍾。

5. 將eppendorf管放入沸水浴中，50秒後立即取出。

6. 用微量離心機4℃下12000g離心10分鍾。

7. 用無菌牙簽從eppendorf管中去除細菌碎片。

8. 取20ml進行電泳檢查。

(三) 酚氯仿裂解法：

1. 從瓊脂平板上挑取轉化菌陽性克隆，接種到標准LB培養液中（含有卡那黴素30 μg/mL）搖菌12 h；收集1.5 mL菌液，8000 g/min離心3 min，棄上清，沉澱加入200 μL TE，充分混勻；加入400 μL酚氯仿（1∶1體積）混合液，劇烈振動10 s，混勻；12 000 g/min離心5 min，1 mL胰島素注射針收集上清，盡量避免吸入蛋白沉澱層；上清經國產0。22 μm針式濾器過濾1次；向過濾上清液內加入2倍體積無水乙醇，振盪10 s，12 000 g/min離心5 min；沉澱溶於20 μL的RTE溶液中，37℃水浴。

2. 按PstI內切酶說明書進行酶切反應（37℃，1 h）。 酶切產物10 μL，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳。

3. PCR引物根據參考文獻〔1〕設計，預計擴增產物片斷大小為714 bp。

4. 常規制備感受態菌E。coli DH5a，提取質粒DNA常規轉化感受態，塗於含有卡那黴素（30 μ/mL）LB培養平板中，37℃培養，15 h後觀察篩選克隆情況。

三、質粒提取常見問題

(一) 溶液I—溶菌液：

溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌體細胞壁的主要化學成分肽聚糖中的β-1,4糖苷鍵，因而具有溶菌的作用。當溶液中pH小於8時，溶菌酶作用受到抑制。

葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機械剪切力作用而降解。

EDTA：1. 螯合Mg2＋、Ca2＋等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶對DNA的降解作用（DNase作用時需要一定的金屬離子作輔基）;2. EDTA的存在，有利於溶菌酶的作用，因為溶菌酶的反應要求有較低的離子強度的環境。

(二) 溶液II－NaOH－SDS液：

NaOH：核酸在pH大於5，小於9的溶液中，是穩定的。但當pH＞12或pH＜3時，就會引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。在溶液II中的NaOH濃度為0.2mo1／L，加抽提液時，該系統的pH就高達12.6，因而促使染色體DNA與質粒DNA的變性。

SDS：SDS是離子型表面活性劑。它主要功能有：1. 溶解細胞膜上的脂質與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜。2. 解聚細胞中的核蛋白。3. SDS能與蛋白質結合成為R-O-SO3-…R＋-蛋白質的復合物，使蛋白質變性而沉澱下來。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以後的提取過程中，必須把它去除干凈，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA時）受到干擾。

(三) 溶液III--3mol／L NaAc（pH4.8）溶液：

NaAc的水溶液呈鹼性，為了調節pH至4.8，必須加入大量的冰醋酸。所以該溶液實際上是NaAc-HAc的緩沖液。用pH4.8的NaAc溶液是為了把pH12.6的抽提液，調回pH至中性，使變性的質粒DNA能夠復性，並能穩定存在。而高鹽的3mol／L NaAc有利於變性的大分子染色體DNA、RNA以及SDS-蛋白復合物凝聚而沉澱之。前者是因為中和核酸上的電荷，減少相斥力而互相聚合，後者是因為鈉鹽與SDS－蛋白復合物作用後，能形成較小的鈉鹽形式復合物，使沉澱更完全。

(四) 為什麼用無水乙醇沉澱DNA？

用無水乙醇沉澱DNA，這是實驗中最常用的沉澱DNA的方法。乙醇的優點是可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會起任何化學反應，對DNA很安全，因此是理想的沉澱劑。

DNA溶液是DNA以水合狀態穩定存在，當加入乙醇時，乙醇會奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易於聚合。一般實驗中，是加2倍體積的無水乙醇與DNA相混合，其乙醇的最終含量佔67％左右。因而也可改用95％乙醇來替代無水乙醇（因為無水乙醇的價格遠遠比95％乙醇昂貴）。但是加95％的乙醇使總體積增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA損失也增大，尤其用多次乙醇沉澱時，就會影響收得率。折中的做法是初次沉澱DNA時可用95％乙醇代替無水乙酵，最後的沉澱步驟要使用無水乙醇。也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉澱DNA。一般在室溫下放置15－30分鍾即可。

(五) 在用乙醇沉澱DNA時，為什麼一定要加NaAc或NaCl至最終濃度達0.1～0.25mol/L？

在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負電荷的，加一定濃度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的負電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易於互相聚合而形成DNA鈉鹽沉澱，當加入的鹽溶液濃度太低時，只有部分DNA形成DNA鈉鹽而聚合，這樣就造成DNA沉澱不完全，當加入的鹽溶液濃度太高時，其效果也不好。在沉澱的DNA中，由於過多的鹽雜質存在，影響DNA的酶切等反應，必須要進行洗滌或重沉澱。

(六) 加核糖核酸酶降解核糖核酸後，為什麼再要用SDS與KAc來處理？

加進去的RNase本身是一種蛋白質，為了純化DNA，又必須去除之，加SDS可使它們成為SDS-蛋白復合物沉澱，再加KAc使這些復合物轉變為溶解度更小的鉀鹽形式的SDS-蛋白質復合物，使沉澱更加完全。也可用飽和酚、氯仿抽提再沉澱，去除RNase。在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到較好效果。

(七) 為什麼在保存或抽提DNA過程中，一般採用TE緩沖液？

在基因操作實驗中，選擇緩沖液的主要原則是考慮DNA的穩定性及緩沖液成分不產生干擾作用。磷酸鹽緩沖系統（pKa＝7.2）和硼酸系統（pKa=9.24）等雖然也都符合細胞內環境的生理范圍(pH)，可作DNA的保存液，但在轉化實驗時，磷酸根離子的種類及數量將與Ca2＋產生Ca3(PO4)2沉澱；在DNA反應時，不同的酶對輔助因子的種類及數量要求不同，有的要求高離子濃度，有的則要求低鹽濃度，採用Tris-HCl（pKa=8.0）的緩沖系統，由於緩沖液是TrisH+/Tris，不存在金屬離子的干擾作用，故在提取或保存DNA時，大都採用Tris-HCl系統，而TE緩沖液中的EDTA更能穩定DNA的活性。

(八) 如何選擇聚乙二醇（6000）的濃度來沉澱DNA？

採用PEG（6000）沉澱DNA，大小不同的DNA分子所用的PEG的濃度也不同，PEG的濃度低，選擇性沉澱DNA分子量大，大分子所需PEG的濃度只需1％左右，小分子所需PEG濃度高達20％。本實驗選擇性沉澱4.3kb的pBR322質粒DNA，每毫升加入0.4毫升的30％ PEG，其最終PEG濃度為12％。PEG選擇性沉澱DNA的解析度大約100bp。

(九) 抽提DNA去除蛋白質時，怎樣使用酚與氯仿較好？

酞與氯仿是非極性分子，水是極性分子，當蛋白水溶液與酚或氯仿混合時，蛋白質分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去，使蛋白失去水合狀態而變性。經過離心，變性蛋白質的密度比水的密度為大，因而與水相分離，沉澱在水相下面，從而與溶解在水相中的DNA分開。而酚與氯仿有機溶劑比重更大，保留在最下層。

作為表面變性的酚與氯仿，在去除蛋白質的作用中，各有利弊，酚的變性作用大，但酚與水相有一定程度的互溶，大約10％～15％的水溶解在酚相中，因而損失了這部分水相中的DNA，而氯仿的變性作用不如酚效果好，但氯仿與水不相混溶，不會帶走DNA。所以在抽提過程中，混合使用酚與氯仿效果最好。經酚第一次抽提後的水相中有殘留的酚，由於酚與氯仿是互溶的，可用氯仿第二次變性蛋白質，此時一起將酚帶走。也可以在第二次抽提時，將酚與氯仿混合（1:1）使用。

(十) 為什麼用酚與氯仿抽提DNA時，還要加少量的異戊酵？

在抽提DNA時，為了混合均勻，必須劇烈振盪容器數次，這時在混合液內易產生氣泡，氣泡會阻止相互間的充分作用。加入異戊醇能降低分子表面張力，所以能減少抽提過程中的泡沫產生。一般採用氯仿與異戊酵為24：1之比。也可採用酚、氯仿與異戊醇之比為25：24:1（不必先配製，可在臨用前把一份酚加一份24：1的氯仿與異戊醇即成），同時異戊醇有助於分相，使離心後的上層水相，中層變性蛋白相以及下層有機溶劑相維持穩定。

(十一) 為什麼要用pH8的Tris水溶液飽和酚？呈粉紅色的酚可否使用？如何保存酚不被空氣氧化？

因為酚與水有一定的互溶，苯酚用水飽和的目的是使其抽提DNA過程中，不致吸收樣品中含有DNA的水分，減少DNA的損失。用Tris調節至pH為8是因為DNA在此條件下比較穩定。在中性或鹼性條件下（pH5～7），RNA比DNA更容易游離到水相，所以可獲得RNA含量較少的DNA樣品。

保存在冰箱中的酚，容易被空氣氧化而變成粉紅色的，這樣的酚容易降解DNA，一般不可以便用。為了防止酚的氧化，可加入疏基乙醇和8-羥基喹琳至終濃度為0.1％。8-羥基喹琳是帶有淡黃色的固體粉末，不僅能抗氧化，並在一定程度上能抑制DNase的活性，它是金屬離子的弱螯合劑。用Tris pH8.0水溶液飽和後的酚，最好分裝在棕色小試劑瓶里，上面蓋一層Tris水溶液或TE緩沖液，隔絕空氣，以裝滿蓋緊蓋子為宜，如有可能，可充氮氣，防止與空氣接觸而被氧化。平時保存在4℃或－20℃冰箱中，使用時，打開蓋子吸取後迅速加蓋，這樣可使酚不變質，可用數月。

(十二) 未提出質粒或質粒得率較低？

1. 大腸桿菌老化

請塗布平板培養後，重新挑選新菌落進行液體培養。

2. 質粒拷貝數低

由於低使用低拷貝數載體引起的質粒DNA提取量低，可更換具有相同功能的高拷

貝數載體。

3. 菌體中無質粒

有些質粒本身不能在某些菌種中穩定存在，經多次轉接後有可能造成質粒丟失。

例如，柯斯質粒在大腸桿菌中長期保存不穩定，因此不要頻繁轉接，每次接種時

應接種單菌落。另外，檢查篩選用抗生素使用濃度是否正確。

4. 鹼裂解不充分

使用過多菌體培養液，會導致菌體裂解不充分，可減少菌體用量或增加溶液P1、

P2和P3的用量。對低拷貝數質粒，提取時，可加倍使用溶液P1、P2和P3，可能

有助於增加質粒提取量和質粒質量。

5. 溶液使用不當

溶液P2、P3在溫度較低時可能出現渾濁，應置於37℃保溫片刻直至溶解為清亮的

溶液，才能使用。

6. 吸附柱過載

不同產品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的質粒量很大，請分多次提取。若

用富集培養基，例如TB 或2×YT，菌液體積必須減少；若質粒或宿主菌是非常高

的拷貝數或生長率，則需調整LB培養液體積。

7. 質粒未全部溶解（尤其質粒較大時）

洗脫溶解質粒時，可適當加溫或延長溶解時間。

8. 乙醇殘留

漂洗液洗滌後應離心盡量去除殘留液體，樹脂型試劑盒漂洗後應晾乾樹脂，再加

入洗脫緩沖液。

9. 洗脫液加入位置不正確

洗脫液應加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會完全覆蓋硅膠膜的表面達到最大洗脫

效率。

10. 洗脫液不合適

DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫，如洗脫緩沖液EB (10 mM Tris?Cl, pH 8.5)

或水。洗脫效率取決於pH值。最大洗脫效率在pH7.0-8.5間。當用水洗脫時確保

其pH值在此范圍內，如果pH過低可能導致洗脫量低。洗脫時將滅菌蒸餾水或洗脫

緩沖液加熱至60℃後使用有利於提高洗脫效率。

11. 洗脫體積太小

洗脫體積對回收率有一定影響。隨著洗脫體積的增大回收率增高，但產品濃度降

低。為了得到較高的回收率可以增大洗脫體積。

12. 洗脫時間過短

洗脫時間對回收率也會有一定影響。洗脫時放置一分鍾可達到較好的效果。

(十三) 質粒純度不高？

1. 混有蛋白

不要使用過多菌體。溶液P1、P2、P3處理並離心後溶液應為澄清的，如果還混有

微小蛋白懸浮物，可再次離心去除後再進行下一步驟。

2. 混有RNA

RNase A處理不徹底，請減少菌體用量或加入溶液P3之後室溫放置一段時間。如

果溶液P1已保存6個月以上，請在溶液P1中添加RNase A。

3. 混有基因組DNA

加入溶液P2和P3後應溫和混勻，如果劇烈振盪，可能把基因組DNA剪切成碎片從

而混雜在質粒中。如果加入溶液P2後過於粘稠，無法溫和混勻，請減少菌體用

量。細菌培養時間過長會導致細胞和DNA的降解，不要超過16 小時。

4. P3溶液加入時間過長

P3溶液加入後，放置時間不要太長，否則有可能會產生小片段DNA污染。

5. 含大量核酸酶的宿主菌

宿主菌含大量核酸酶，在質粒提取過程中降解質粒DNA，影響提取質粒DNA的完

整性，最好選用不含核酸酶的大腸桿菌宿主菌，如DH5α和Top10。

6. 裂解時間過長

加入溶液P2後裂解時間不應超過5分鍾。

7. 質粒的二聚體和多聚體形式

質粒復制過程中形成的，與宿主菌相關，電泳可檢測出。

H. 質粒提取的原理和步驟

本文章首先從溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ開始講解:
溶液I，50 mM葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；
溶液II，0.2 M NaOH / 1% SDS；
溶液III，3 M醋酸鉀/ 2 M醋酸。

溶液I的作用
任何生物化學反應，首先要控制好溶液的pH，因此用適當濃度的和適當pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不過的了。那麼50 mM葡萄糖是干什麼的呢？說起來不可思議，加了葡萄糖後最大的好處只是懸浮後的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其實對質粒的抽提本身而言，幾乎沒有任何影響。所以說溶液I中葡萄糖是可缺的。那麼EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二價金屬離子的螯合劑，配在分子生物學試劑中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生長。在溶液I中加入高達10 mM的EDTA，無非就是要把大腸桿菌細胞中的所有二價金屬離子都螯合掉。如果不加EDTA，其實也沒什麼大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太長的時間里完成質粒抽提，就不用怕DNA會迅速被降解，因為最終溶解質粒的TE緩沖液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提質粒呢？實話告訴你，只要用等體積的水，或LB培養基來懸浮菌體就可以了。有一點不能忘的是，菌體一定要懸浮均勻，不能有結塊。

溶液Ⅱ的作用
這是用新鮮的0.4 N的NaOH和2％的SDS等體積混合後使用的。要先從濃NaOH稀釋制備0.4N的NaOH，無非是為了保證NaOH沒有吸收空氣中的CO2而減弱了鹼性。很多人不知道其實破細胞的主要是鹼，而不是SDS，所以才叫鹼法抽提。事實上NaOH是最佳的溶解細胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動物細胞，碰到了鹼都會幾乎在瞬間就溶解，這是由於細胞膜發生了從bilayer（雙層膜）結構向micelle（微囊）結構的相變化所導致。用了不新鮮的0.4 N NaOH，即便是有SDS也無法有效溶解大腸桿菌（不妨可以自己試一下），自然就難高效率抽提得到質粒。如果只用SDS當然也能抽提得到少量質粒，因為SDS也是鹼性的，只是弱了點而已。很多人對NaOH的作用誤以為是為了讓基因組DNA變性，以便沉澱，這是由於沒有正確理解一些書上的有關DNA變性復性的描述所導致。有人不禁要問，既然是NaOH溶解的細胞，那為什麼要加SDS呢？那是為下一步操作做的鋪墊。這一步要記住兩點：第一，時間不能過長，千萬不要這時候去接電話，因為在這樣的鹼性條件下基因組DNA片斷會慢慢斷裂；第二，必須溫柔混合（象對待女孩子一樣），不然基因組DNA也會斷裂。基因組DNA的斷裂會帶來麻煩，後面我再詳細說明。

溶液Ⅲ的作用
溶液Ⅲ加入後就會有大量的沉澱，但大部分人卻不明白這沉澱的本質。最容易產生的誤解是，當SDS碰到酸性後發生的沉澱。如果你這樣懷疑，往1%的SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是這么回事了。大量沉澱的出現，顯然與SDS的加入有關系。如果在溶液II中不加SDS會怎樣呢，也會有少量的沉澱，但量上要少得多，顯然是鹽析和酸變性沉澱出來的蛋白質。既然SDS不是遇酸發生的沉澱，那會不會是遇鹽發生的沉澱呢？在1％的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你會發現SDS在高鹽濃度下是會產生沉澱的。因此高濃度的鹽導致了SDS的沉澱。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你會發現沉澱的量要多的多。這其實是十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate）遇到鉀離子後變成了十二烷基硫酸鉀（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此發生了沉澱。如此看來，溶液III加入後的沉澱實際上是鉀離子置換了SDS中的鈉離子形成了不溶性的PDS，而高濃度的鹽，使得沉澱更完全。大家知道SDS專門喜歡和蛋白質結合，平均兩個氨基酸上結合一個SDS分子，鉀鈉離子置換所產生的大量沉澱自然就將絕大部分蛋白質沉澱了，讓人高興的是大腸桿菌的基因組DNA也一起被共沉澱了。這個過程不難想像，因為基因組DNA太長了，長長的DNA自然容易被PDS給共沉澱了，盡管SDS並不與DNA分子結合。

那麼2 M的醋酸又是為什麼而加的呢？是為了中和NaOH，因為長時間的鹼性條件會打斷DNA，所以要中和之。基因組DNA一旦發生斷裂，只要是50－100 kb大小的片斷，就沒有辦法再被PDS共沉澱了。所以鹼處理的時間要短，而且不得激烈振盪，不然最後得到的質粒上總會有大量的基因組DNA混入，瓊脂糖電泳可以觀察到一條濃濃的總DNA條帶。很多人誤認為是溶液III加入後基因組DNA無法快速復性就被沉澱了，這是天大的誤會，因為變性的也好復性的也好，DNA分子在中性溶液中都是溶解的。NaOH本來是為了溶解細胞而用的，DNA分子的變性其實是個副產物，與它是不是沉澱下來其實沒有關系。溶液III加入並混合均勻後在冰上放置，目的是為了PDS沉澱更充分一點。

不要以為PDS沉澱的形成就能將所有的蛋白質沉澱了，其實還有很多蛋白質不能被沉澱，因此要用酚/氯仿/異戊醇進行抽提，然後進行酒精沉澱才能得到質量穩定的質粒DNA，不然時間一長就會因為混入的DNase而發生降解。這里用25/24/1的酚/氯仿/異戊醇是有很多道理的，這里做個全面的介紹。酚（Phenol）對蛋白質的變性作用遠大於氯仿，按道理應該用酚來最大程度將蛋白質抽提掉，但是水飽和酚的比重略比水重，碰到高濃度的鹽溶液（比如4M的異硫氰酸胍），離心後酚相會跑到上層，不利於含質粒的水相的回收；但加入氯仿後可以增加比重，使得酚/氯仿始終在下層，方便水相的回收；還有一點，酚與水有很大的互溶性，如果單獨用酚抽提後會有大量的酚溶解到水相中，而酚會抑制很多酶反應（比如限制性酶切反應），因此如果單獨用酚抽提後一定要用氯仿抽提一次將水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液進行抽提，跑到水相中的酚則少得多，微量的酚在乙醇沉澱時就會被除干凈而不必擔心酶切等反應不能正常進行。至於異戊醇的添加，其作用主要是為了讓離心後上下層的界面更加清晰，也方便了水相的回收。
回收後的水相含有足夠多的鹽，因此只要加入2倍體積的乙醇，在室溫放置幾分鍾後離心就可以將質粒DNA沉澱出來。這時候如果放到－20℃，時間一長反而會導致大量鹽的沉澱，這點不同於普通的DNA酒精沉澱回收，所以不要過分小心了。高濃度的鹽會水合大量的水分子，因此DNA分子之間就容易形成氫鍵而發生沉澱。如果感覺發生了鹽的沉澱，就用70％的乙醇多洗幾次，每次在室溫放置一個小時以上，並用tip將沉澱打碎，就能得到好的樣品。得到的質粒樣品一般用含RNase（50 ug/ml）的TE緩沖液進行溶解，不然大量未降解的RNA會干擾電泳結果的。

瓊脂糖電泳進行鑒定質粒DNA時，多數情況下你能看到三條帶，但千萬不要認為你看到的是超螺旋、線性和開環這三條帶。鹼法抽提得到質粒樣品中不含線性DNA，不信的話你用EcoRI來線性化質粒後再進行瓊脂糖電泳，就會看到線性質粒DNA的位置與這三條帶的位置不一樣。其實這三條帶以電泳速度的快慢而排序，分別是超螺旋、開環和復制中間體（即沒有復制完全的兩個質粒連在了一起）。如果你不小心在溶液II加入後過度振盪，會有第四條帶，這條帶泳動得較慢，遠離這三條帶，是20-100kb的大腸桿菌基因組DNA的片斷。非常偶然的是，有時候抽提到的質粒會有7－10條帶，這是由於特殊的DNA序列導致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈數不同）所致。這里暫不深究。

I. 質粒提取的注意事項

1、利用氯黴素抑制染色體的復制，而不抑制質粒的復制這一特點，在低拷貝質粒（如pUC19）的培養過程中添加氯黴素可以大大提高得率。

2、RNA 的去除，首先是使用 RNase 消化。在溶液 I 中加入高濃度的 RNase A (100ug/ml)，或者用含 25ug RNase A/ml TE 溶解抽提好的質粒，都可以降低 RNA 殘留，但都不能徹底去除。

3、蛋白質的去除，主要是靠不溶解的 K-SDS-蛋白質復合物的形成。雖然將中和後的體系置於 4C 一段時間，可以形成更多的該不溶復合物，從而使蛋白質殘留更少，但實踐證明這樣做並不是必須的，除非是大量抽提。

首先，質粒的提取可分為質粒小提、質粒中提、質粒大提。目前大多數實驗室都選用試劑盒進行提取，可以根據實驗的不同需求，選擇相應的試劑盒。

質粒小提主要用於用於大腸桿菌中質粒DNA的小量提取，獲得的質粒可以用於常規的載體構建，一般適用於5ml以下菌液。

而質粒中提，在小提的基礎上可以進一步去除菌液中的內毒素，獲得的質粒可以用於細胞轉染，常規需要菌液量為10-15ml。質粒大提與中提方法相同，可一次抽提100ml-300ml菌液獲得大量質粒。

(9)質粒小提時間為什麼比大提時間短擴展閱讀

質粒提取的原理：質粒抽提的步驟原理即去除RNA，將質粒與細菌基因組DNA分開，去除蛋白質及其它雜質，以得到相對純凈的質粒。最常用的方法是鹼裂解法,即在強鹼性條件下，質粒DNA和基因組DNA同時從細胞中釋放出來，並發生變性。

在pH中性，並有高鹽濃度存在的條件下，質粒DNA會迅速發生復性，仍為可溶性狀態，染色體DNA之間交聯形成不溶性網狀結構，在去垢劑SDS作用下，染色體DNA與變性蛋白質和細胞碎片結合形成沉澱，通過離心去除沉澱後。

再用酚氯仿抽提進一步純化質粒DNA，用異丙醇或乙醇沉澱可將之純化出來。優點為操作過程簡單，快速，獲得質粒濃度高，目前被廣泛使用。

J. 提質粒時說的大提和小提是什麼意思希望能說的詳細點，新手，謝謝

大提是大量提，小提是小量提。